大鼠原代角膜成纤维细胞培养是眼科基础研究中常用的细胞培养技术，核心是通过规范操作获得高纯度、高活性的成纤维细胞，以下是完整的标准化培养方案：
一、取材与原代分离操作
?动物预处理?：选取新生1天的SD大鼠，75%酒精全身消毒后，在无菌超净台内快速摘取完整眼球，置于预冷的无菌PBS缓冲液中。
?组织剥离?：在解剖显微镜下小心剥离角膜上皮层和内皮层，仅保留中间的角膜基质层，用预冷PBS反复漂洗3次去除残留血污。
?消化分散?：将角膜基质组织剪碎至1mm3大小，加入0.125%胰蛋白酶，37℃水浴消化20分钟，加入等体积含10%胎牛血清的DMEM完全培养基终止消化。
?接种培养?：将消化后的细胞悬液经200目细胞筛过滤，1000rpm离心5分钟，弃上清后用完全培养基重悬，接种于预先包被多聚赖氨酸的培养瓶中，置于37℃、5%CO?培养箱静置培养。
二、日常传代培养操作
待细胞贴壁生长至瓶底汇合度达80%~90%时即可进行传代，弃去原瓶中的旧培养液，用无菌PBS清洗细胞1~2次。
推荐两种低损伤传代方法：
?直接吹打法?：保留部分旧培养基，用移液管直接对瓶壁细胞轻柔吹打，使细胞脱落，混匀后直接分瓶培养，可避免胰酶消化导致的细胞形态改变。
?HEPES辅助吹打法?：向原培养基中滴加1~2滴无菌HEPES缓冲液，作用1~2分钟使培养基pH变酸，此时细胞极易被吹打成单细胞悬液，混匀后分瓶培养。
传代比例推荐1:2~1:3，分瓶后置于培养箱中继续培养，3~4小时内大部分细胞即可重新贴壁。
三、关键培养注意事项
该细胞对培养基和血清质量要求较高，传代3~4代后易出现细胞分化，表现为细胞体积变大、贴壁过紧，呈“摊鸡蛋”样形态，建议实验使用3代以内的细胞。
不推荐常规胰酶长时间消化或细胞刮刮取细胞，前者易导致细胞形态改变，后者易造成大量细胞死亡，大幅降低细胞活率。
严格执行无菌操作，定期清洁细胞培养箱，避免真菌污染；操作过程中避免剧烈摇晃细胞悬液，减少温度波动，防止细胞活性受损。
原代细胞不建议多次传代后用于实验，收到细胞后可尽早分瓶冻存部分种子细胞，避免后续细胞状态变差影响实验进度。
