小鼠原代真皮成纤维细胞的分离与培养
1. 组织消化与细胞分离
将剪碎的真皮组织转移至15 mL离心管中，加入预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（含1%胶原酶Ⅰ），37℃水浴消化30分钟，期间每10分钟轻柔吹打一次以促进组织解离。消化完成后，加入等体积含10% FBS的DMEM培养基终止反应，1000 rpm离心5分钟，弃上清。
2. 细胞悬液制备与接种
用PBS重悬细胞沉淀，经70 μm细胞筛过滤去除未消化的组织块，再次离心后以完全培养基（DMEM+10% FBS+1%双抗）重悬。调整细胞密度至5×10? cells/mL，接种于预先包被0.1%明胶的培养皿中，置于37℃、5% CO?培养箱中静置培养。
3. 原代细胞培养与观察
24小时后更换新鲜培养基以去除未贴壁细胞，此后每2-3天换液一次。在倒置显微镜下观察，成纤维细胞通常呈梭形或多角形，贴壁生长后可形成典型的放射状或漩涡状排列。若发现杂细胞（如角质形成细胞）污染，可采用差速贴壁法纯化：将细胞悬液接种30分钟后，转移未贴壁细胞至新培养皿继续培养。
4. 细胞传代与冻存
当细胞融合度达80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化2-3分钟，按1:2至1:3比例传代。冻存时以含10% DMSO的完全培养基调整细胞密度至1×10? cells/mL，分装至冻存管后程序降温，长期保存于液氮中。
注意事项
- 组织消化时间需根据小鼠年龄调整（幼鼠组织更易消化）；
- 原代细胞前3代增殖活跃，建议优先使用P3-P5代细胞进行实验；
- 定期检测支原体污染，培养液中可添加2.5 μg/mL两性霉素B预防真菌污染。
