产品分类

CHO 残留 DNA 检测试剂盒(PCR-荧光探针法)
物品单位 品牌
帛科
  • 发布日期: 2022-10-14
  • 更新日期: 2022-10-17
产品详细说明
产地
品牌 帛科
货号
用途范围
纯度 %
CAS编号
规格
是否进口
CHO 残留 DNA 检测试剂盒(PCR-荧光探针法)试剂盒简介:

CHO 残留DNA 检测试剂盒是用于定量检测各种生物制品及药品的中间品、半成品和成 品中残留的 CHO  宿主细胞 DNA。
本试剂盒利用 Taqman 探针法, 定量检测样本中 CHO  残留 DNA。该方法具有速度快、 特异性高、  性能可靠且 检测限可达到 fg 级别。
试剂盒组份:

表 1:试剂盒组份

试剂 装量 贮存条件
CHO control DNA 40ul×1 管 -20oC
DNA dilution buffer 6ml ×1 瓶 -20oC
2×Taqman master mix (+UNG/ROX) 0.75ml ×2 管 -20oC
10×CHO qPCR mix 0.3ml ×1 管 -20oC
RNase-Free H2O 1.5ml×1 管 -20oC
规格 :100  反应
适用机型:
PRISM 7500 Real-Time PCR System (ABI)
StepOne Plus Real-Time PCR System (ABI)
LightCycler 480 (Roche)
AriaMX (Agilent Technologies)
CFX (BIO-RAD)

实验所需但试剂盒未包含材料:

? 1.5ml 无菌低吸附离心管
? 96 孔 qPCR  板
? 一次性手套
? 1000ul 、100ul 、10ul 无菌低吸附带滤芯移液枪头

实验操作过程:


一、 CHO DNA 定量参考品的稀释及标准曲线的制备

用试剂盒中提供的 DNA dilution buffer CHO control DNA 进行梯度稀释, 稀释浓度依 次为 300pg/ul 、30pg/ul 、3pg/ul 、300fg/ul 、30fg/ul 、3fg/ul 。具体操作如下:

1.将试剂盒中的 CHO control DNA DNA dilution buffer 置于冰上融化,待完全融化后,

轻微振荡混匀,简短快速离心。

2. 6 支干净的 1.5ml 离心管,分别标记为 SD1 SD2 SD3 SD4 SD5, SD6

3SD1 管中加入 198ul DNA dilution buffer,其余管中分别加入 180ul DNA dilution buffer

4, 2ul  CHO  control  DNA 加入 SD1 管中, 然后涡旋振荡混匀 5- 10s 后短时快速离心 5s,涡旋振荡和快速离心各重复 3 次。

5,按表 2 依次进 6 次梯度稀释操作,稀释操作同步骤 4。

2. CHO control DNA 的稀释

释管

释体积

浓度

SD1

2ul CHO control DNA+198ul DNA dilution buffer

300 pg/ul

SD2

20ul SD1+180ul DNA dilution buffer

30 pg/ul

SD3

20ul SD2+180ul DNA dilution buffer

3 pg/ul

SD4

20ul SD3+180ul DNA dilution buffer

300 fg/ul

SD5

20ul SD4+180ul DNA dilution buffer

30 fg/ul

SD6

20ul SD5+180ul DNA dilution buffer

3 fg/ul

二、加样回收质控 ERC 的制备

根据待测样本的残留量设置 ERC CHO  control  DNA 的加样浓度 (以制备加 45pg  CHO control DNA 的样本 ERC 为例),操作如下:

1,取待测样本 100u,加至 1.5ml 净的离心管中;

2,加入 1.5ul SD2,混匀,标记为样本 ERC。

:样本 ERC 和同批待测样本需一起进行样本前处理。

三、阴性质控 NEG 的制备

根据实验设置阴性质控,操作如下:

1,取 100ul 样本基质溶液(或洗脱液)加至 1.5ml 干净的离心管中标记为阴性质控 NEG。 注:阴性质控 NEG 样本和同批待测样本需一起进行样本前处理。

四、 qPCR 反应液的制备和加样

1,根据所要检测的标准曲线及待测样本数量,计算所需反应孔数,一般做 3 个重复孔/样。

反应孔数=  (6 个浓度梯度+1 个无模板对照 NTC+1 个阴性质控 NEG+待测样本×2) ×3 注:待测样本×2 是为了让每个待测样本检测时都同时做样本 ERC 。                  2,根据反应孔数计算本次实验所需的各组分的所需总量以制备 pre-mix:

2×Taqman master mix=(反应孔数+2) ×15ul    (含有 2 孔的损失量)

10×CHO qPCR mix=  (反应孔数+2) ×3ul

RNase-free H2O=  (反应孔数+2) ×2ul

3,各试剂置于冰上融化,振荡混匀,按表 3 所示进行加样:

表 3.各反应孔加样示例


标准曲线

20ul pre-mix+ 10ul SD1/SD2/SD3/SD4/SD5/SD6

NTC

20ul pre-mix+ 10ul DNA dilution buffer

NEG

20ul pre-mix+ 10ul NEG

测样本

20ul pre-mix+ 10ul 待测样本

ERC 样本

20ul pre-mix+ 10ul ERC 样本


加样完成后每孔总体积为 30ul