标准品梯度精准配制
用试剂盒自带的指定稀释液复溶冻干总胆固醇标准品，涡旋混匀10-15分钟，充分溶解后室温平衡20-30分钟，避免低温试剂引发浓度不均。
采用?倍比稀释法?配制至少6个梯度浓度，浓度跨度完全覆盖待测样本的预期浓度范围，同时设置空白零浓度孔，保证所有样本浓度落在曲线中间最陡的线性段内。
每步梯度稀释后更换新吸头和离心管，按「空白对照→低浓度标准品→高浓度标准品」的顺序加样，每个浓度设置2个复孔，最大程度降低交叉污染和移液误差。
OD值采集与预处理
标准品与待测样本在同一块酶标板同步检测，避免板间操作差异引入系统偏差。
酶标仪选择?450nm主波长+630nm参比波长?读取吸光度，直接扣除微孔材质本身的背景干扰。
数据预处理：先计算双复孔的平均OD值，再统一减去空白孔的平均OD值，得到校正后的OD-blank值；直接剔除复孔CV＞10%的异常孔，重新复测该浓度点。
曲线拟合与绘制
人总胆固醇ELISA多为竞争法检测，优先选择?四参数Logistic模型?拟合，适配S型曲线的全浓度范围，拟合精度远高于普通线性回归，强制要求R2≥0.99。
用Curve Expert软件操作时，X轴输入校正后的OD-blank值，Y轴输入对应标准品浓度，筛选r值最接近1的最优拟合方程，即可直接代入样本OD值计算浓度。
坐标轴设置：X轴为总胆固醇标准品的已知浓度，Y轴为校正后的OD-blank值，标注拟合方程、R2值、实验日期等关键信息，保证曲线可溯源。
标曲有效性刚性校验
空白孔OD值必须＜0.1，若超出阈值需排查试剂污染、洗板不彻底等背景干扰问题。
每块酶标板必须独立绘制专属标准曲线，绝对不能跨板套用历史标曲，彻底消除批次间系统偏差。
随机抽取1个中间浓度标准品作为质控回算点，回算浓度偏差控制在±10%以内，确认标曲拟合有效性。
所有待测样本的OD值必须落在标曲有效区间内，严禁通过外延法推算超出标曲上下限的样本浓度，超出范围的样本需调整稀释比例后重新上机检测。
